Плавление ДНК - процесс перехода регулярной двойной спирали линейной молекулы ДНК в клубкообразное состояние. Переход спираль-клубок может быть вызван различными факторами, но, как правило, исследуется температурный переход. Наблюдение за переходом может осуществляться различными методами, так как он сопровождается изменением многих физических свойств ДНК ( Кантор Ч. и Шиммел П., 1984), наиболее часто для количественных измерений степени перехода используется изменение поглощения света раствором ДНК в области длин волнa l = 250-270 нм. При переходе ДНК из спирального состояния в клубкообразное поглощение раствора A в этой области длин волн увеличивается на 30-40%, и для определения средней степени перехода q, т.е. доли звеньев, находящихся в клубкообразном состоянии, можно использовать соотношение:

q, = (A - A сп)/(A кл - A сп) (1),

где через A сп и A кл обозначено поглощение ДНК в полностью спиральном и полностью клубкообразном состоянии, соответственно. Этот метод позволяет регистрировать q,с точностью, превышающей 0,1%. Плавление высокомолекулярной ДНК занимает интервал температур от 3 до 20 градусов в зависимости от распределения AT- и GC-пар вдоль молекулы. В качестве простейшей характеристики плавления такой ДНК обычно используют температуру плавления T m , которая определяется как температура, при которой половина звеньев молекулы находится в клубкообразном состоянии. При заданном составе растворителя температура плавления линейно зависит от доли GC-пар в ДНК, x GC ( Кантор Ч. и Шиммел П., 1984):

Т m = Т АТ + (Т GC - T AT)*x GC (2),

где через T AT и T GC обозначены температуры плавления молекул ДНК, состоящих только из AT- и только из GC-пар, соответственно.

В середине 70-х годов было обнаружено, что кривая плавления ДНК, т.е. зависимость q от T, обладает тонкой структурой, если длина ДНК не превышает нескольких десятков тысяч пар оснований ( Dickerson R.E., 1983). Особенно ярко эта тонкая структура проявляется на дифференциальной кривой плавления, т. е. зависимости dq/dT от T. Пример такой дифференциальной кривой плавления приведен на для фрагмента ДНК фага fd. Конкретный профиль плавления, который отражают такие кривые, определяется последовательностью оснований в исследуемой ДНК. Эти пики на дифференциальных кривых плавления связаны с выплавлением в интервале в несколько десятых градуса отдельных участков молекулы с характерным размером в несколько сотен пар оснований.

Существует хорошо разработанное статистико-механическое описание перехода спираль-клубок в ДНК. Открытие тонкой структуры кривых плавления и расшифровка длинных последовательностей ДНК позволили провести очень критичную проверку возможностей теоретического описания перехода спираль-клубок. Прямое сравнение теоретических и экспериментальных профилей плавления ДНК длиной до нескольких тысяч пар оснований показало, что статистико- механическая модель перехода хорошо описывает реальное плавление ДНК. Достаточно типичный пример такого сравнения показан на Рис. Дифференциальные кривые плавления .

Плавление отрицательно сверхспирализованной ДНК начинается при значительно более низких температурах, чем плавление соответствующих линейных молекул, а заканчивается при значительно более высоких температурах. Ясно, что до тех пор, пока знак напряжения сверхспирализации способствует раскручиванию двойной спирали, т.е. пока степень денатурации q меньше величины s, это напряжение должно способствовать денатурации. При q больше или равно s , расплавленные участки начинают приобретать остаточную закрученность, так как кручения в спиральных областях уже недостаточно для реализации имеющегося в молекуле порядка зацепления нитей, и тем самым топологические ограничения затрудняют дальнейшее плавление ДНК . Именно топологические ограничения, а не распределение AT- и GC-пар оснований вдоль цепи и их относительная стабильность, определяют характер плавления кольцевой замкнутой ДНК. Это было убедительно показано в работе ( Gagua A.V. ea, 1981), где изучалось плавление кольцевой замкнутой формы ДНК в тетраметиламмониевых солях, при определенной концентрации которых температуры плавления AT- и GC-пар совпадают. В этих условиях интервал плавления линейной ДНК сужается до нескольких десятых градуса ( Melchior W.B. and von Hippel P.H., 1973 и Воскобойник А.Д. и др., 1975). Однако характер плавления КЗ формы практически не меняется, и переход остается очень широким, начинаясь при 55 градусах С и заканчиваясь при 110 градусах С.

В 1944 г. в экспериментах, проведенных Эвери, Маклеодом и Маккарти, было продемонстрировано, что способность к образованию капсулы у мутантного бескапсульного штамма пневмококков может быть восстановлена посредством введения в его клетки очищенной ДНК пневмококков, способных к синтезу капсулы. Авторы назвали агент (ДНК), ответственный за это изменение, - «трансформирующим фактором». Очень скоро метод трансформации стал широко использоваться в генетических исследованиях. Относительно недавно были проведены эксперименты, в которых реципиентами служили клетки дрожжей, млекопитающих, эмбрионы грызунов и насекомых, а донором генетической информации-клонированная ДНК.

Химические свойства ДНК

Химическая природа мономерных единиц, образующих ДНК (дезоксиаденилат, дезоксицитидилат, дезоксигуанилат и тимидилат), описана в гл. 34. Мономеры полимеризуются с образованием 3, 5-фосфодиэфирных связей, формируя одиночную цепь ДНК (рис. 37. 1). Информация в ДНК записана в виде определенной последовательности пуриновых и пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов.

Полимерная молекула ДНК, как видно из рисунка, полярна. На одном конце расположена 5-гидроксил - (либо фосфатная группа), на другом 3-фосфат-(либо гидроксильная группа). Основываясь на данных рентгеноструктурного анализа ДНК и правиле Чаргаффа, согласно которому в молекуле ДНК содержание остатков дезоксиаденозина (А) равно содержанию тимидина (Т), а содержание дезоксигуанозина (G) равно содержанию дезоксицитозина (С), Уотсон, Крик и Уилкинс предложили в начале 50-х годов модель двухспиральной структуры ДНК. Модель В-формы ДНК изображена на рис. 37.2. Две цепи этой правозакрученной, двухспиральной молекулы удерживаются друг возле друга за счет водородных связей, образующихся между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Образование комплементарных пар строго специфично. А всегда спаривается с (рис. 37. 3).

В двухцепочечной молекуле ограничения, обусловленные заторможенностью вращения вокруг фосфодиэфирной связи, преимущественная «автоконфигурация гликозидных связей (рис. 34.9) и превалирующие таутомерные формы четырех оснований (A, G, Т и С, рис. 34.3) создают условия, в которых А может образовать прочную пару только с Т, a G только с С (рис. 37.3). Именно этим и объясняются правила Чаргаффа (А = Т; G = С). Две цепи двойной спирали, будучи полярными, являются и

Рис. 37.1. Фрагмент структуры молекулы ДНК, в которой пуриновые и пиримидиновые основания аденин (А), тимин (Т), цитозин (С) и гуанин (G) удерживаются вместе фосфодиэфирным остовом, соединяющим -дезоксирибозильные остатки, связанные -гликозидной связью с соответствующими нуклеиновыми основаниями. Обратите внимание: фосфодиэфирный остов единичной цепи ДНК обладает «полярностью» (т. е. в нем можно выделить определенное направление, например ).

антипараллльными, т. е. направление одной цепи , а другой . Такая картина напоминает две параллельные улицы с односторонним движением, направленным в противоположные стороны. Одну из двух комплементарных цепей ДНК, содержащую информацию о структуре определенного гена в виде специфической последовательности нуклеотидов, обычно называют кодирующей (или матричной); другая, комплементарная ей цепь носит название некодирующей.

Как показано на рис. 37.3, между остатками дезоксигуанозина и дезоксицитидина образуются три водородные связи, а между тимидином и дезоксиаденозином - только две. Поэтому связь G-С прочнее примерно на 50%. Этим обстоятельством, а также стэкинг-взаимодействиями и можно объяснить более высокую температуру денатурации (плавления) G-С-богатых областей ДНК.

Структура ДНК

ДНК может формировать несколько типов двойных спиралей. В настоящее время уже известно шесть форм (от А до Е и Z-форма). Большая часть структурных вариантов ДНК может существовать только в строго контролируемых условиях эксперимента. Эти варианты различаются 1) числом пар оснований, приходящихся на один виток двойной спирали; 2) расстоянием между плоскостями пар оснований и углом, который они образуют с осью спирали; 3) диаметром спирали; 4) направленностью (правая, левая) двойной спирали (табл. 37. 1).

Некоторые из этих форм переходят друг в друга при изменении концентрации соли и степени гидратации. Не исключено, что переходы между различными структурными формами ДНК происходят и in vivo.

Рис. 37.2. Модель двухспиральной структуры В-формы по Уотсону и Крику. Слева: Схематическое изображение молекулы (А - аденин, С - цитозин, G - гуанин, Т - тимин, Р - фосфат, S-сахар [дезоксирибоза]). Справа: модель структуры ДНК. (Photograph from J.D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif.)

При физиологических условиях (низкая концентрация соли, высокая степерь гидратации) доминирующим структурным типом ДНК является В-форма. Шаг спирали такой молекулы равен 3,4 нм. Виток ДНК можно представить в виде двух скрученных стопок «монет», по 10 в каждой. Стопки удерживаются водородными связями между двумя противолежащими «монетами» стопок, и «обмотаны» двумя лентами фосфодиэфирного остова, закрученными в правую спираль. В условиях менее высокой гидратации и при более высоком содержании ионов Na+ или К+ возникает несколько иная структура - так называемая A-форма. Эта правоспиральная конформация имеет больший диаметр спирали, чем В-форма, и большее число пар оснований на виток. Она сходна со структурой, характерной для двухцепочечной РНК или для РНК-ДНК-дуплексов. Формы С-Е также правоспиральные, их образование можно наблюдать только в специальных экспериментах, и, по-видимому, они не существуют in vivo.

Z-форма. ДНК представляет собой левозакрученную двойную спираль, в которой фосфодиэфирный остов расположен зигзагообразно вдоль оси молекулы. Отсюда и название молекулы (zigzag)-ДHK. Z-ДНК - наименее скрученная (12 пар оснований на виток) и наиболее тонкая из известных в природе, она обладает только одним желобком (см. ниже). Z-ДНК выявляют в повторяющихся последовательностях чередующихся пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеотидов (GC или АС) при наличии ряда других стабилизирующих факторов. К ним относятся: 1) высокая концентрация соли или наличие специфических катионов, таких, как спермин и спермидин; 2) высокое содержание отрицательных супервитков в молекуле ДНК (см. гл. 38); 3) связывание Z-ДНК-специфичных белков; 4) метилирование атома углерода-5 некоторых остатков дезоксицитидина.

ДНК в Z-форме может участвовать в регуляции экспрессии генов как близко расположенных, так и существенно удаленных от Z-участка. Некоторые белки, связывающиеся в большой или малой бороздках В-формы ДНК, вероятно, не способны связываться с Z-формой ДНК. Кроме того, реверсия участка ДНК из Z-формы в В-форму ДНК, которая происходит, например, в результате потери метальных групп -метилдезоксицитидином. может влиять на торсионный статус участков ДНК, расположенных на значительном расстоянии от области реверсии.

Рис. 37.3. Образование двух водородных связей (пунктирная линия) между основаниями дезоксиаденозина и тими-дина (вверху) и трех водородных связей между основаниями дезоксигуанозина и дезоксицитидина (внизу). В ДНК углеводным остатком является 2-дезоксирибоза, в РНК D-рибоза

Торсионное скручивание-раскручивание ДНК так же, как и метилирование дезоксицитидина, вероятно, влияет на активность генов (см. ниже).

Наличие Z-ДНК в хромосомах Drosophila (плодовая мушка) было показано с применением антител специфичных к Z-форме ДНК. В ДНК человека имеются участки, потенциально способные переходить в Z-форму; они диспергированы в геноме.

Таблица 37.1. Характеристика некоторых типов структур ДНК

Есть основания предполагать, что и в клетках человека могут реализоваться условия, необходимые для стабилизации Z-формы.

Денатурация (плавление) ДНК

Двухспиральную структуру ДНК можно «расплавить» в растворе, повышая температуру или понижая концентрацию соли. При плавлении происходит не только расхождение цепей ДНК, но и нарушается система стэкинг-взаимодействий нуклеиновых оснований внутри данной цепи. Фосфодиэфирные связи при этом не разрываются. Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом денатурации ДНК. При денатурации исчезает также высокая вязкость, присущая растворам нативной ДНК, волоконноподобная структура которой обусловлена как стэкинг-взаимодействиями нуклеиновых оснований в каждой цепи, так и комплементарными взаимодействиями между двумя цепями.

Разделение цепей данной молекулы ДНК происходит в пределах определенного интервала температур. Средняя точка этого интервала называется температурой плавления ДНК или . Значение зависит от нуклеотидного состава ДНК и концентрации соли в растворе. Молекулы ДНК, обогащенные G-С-парами (они связаны тремя водородными мостиками), «плавятся» при более высокой температуре, чем А-Т-богатые молекулы (пары А-Т связаны двумя водородными мостиками). Десятикратное увеличение концентрации моновалентных катионов увеличивает на 16,6° С. Формамид, обычно используемый в экспериментах с рекомбинантной ДНК, дестабилизирует водородные связи между основаниями, тем самым снижая . Это позволяет цепям ДНК или ДНК-РНК-гибрида расходиться при более низкой , что уменьшает вероятность разрыва индивидуальных цепей, происходящего при высокой температуре.

Бороздки в структуре ДНК

При изучении модели, изображенной на рис. 37.2, можно обратить внимание на наличие в структуре ДНК большой и малой бороздок, закрученных вокруг оси молекулы параллельно фосфодиэфирному остову. В этих бороздках белки могут специфически взаимодействовать с определенными атомами нуклеиновых оснований, а значит, и «узнавать» конкретные нуклеотидные последовательности, не нарушая комплементарных взаимодействий в структуре двойной спирали. Как будет показано в гл. 39 и 41, именно за счет таких взаимодействий регуляторные белки могут осуществлять контроль экспрессии генов.

Релаксированная и суперспиральная ДНК

ДНК некоторых организмов, таких, как бактерии, бактериофаги и многие ДНК-содержащие вирусы животных, представляет собой замкнутую кольцевую структуру. Конечно, такая структура не нарушает полярность молекул, но в ней исчезают свободные и -гидроксильные и фосфорильные группы. Замкнутые кольца могут существовать в релаксированной или суперспиральной формах. Суперспиральность проявляется тогда, когда замкнутое кольцо сворачивается вокруг собственной оси или когда скручивается участок линейной ДНК, концы которой зафиксированы. Этот требующий энергии процесс приводит к появлению внутримолекулярного напряжения структуры. При увеличении числа супервитков внутреннее (торсионное) напряжение возрастает (проверьте это на обычной резиновой ленте). Супервитки в ДНК, образованные за счет скручивания против часовой стрелки (в направлении, обратном закручиванию правосторонней двойной спирали В-формы ДНК), называются отрицательными. В некотором смысле можно считать, что энергия, необходимая для достижения такого структурного состояния, запасается в обычных (неотрицательных) супервитках. Энергия перехода молекулы ДНК к другому типу надмолекулярной структуры может понижаться за счет образования участков отрицательного скручивания. Один из таких переходов - разделение цепей при подготовке к репликации и транскрипции. Вот почему суперспирализация ДНК весьма выгодна в биологических системах. Ферменты, катализирующие топологические изменения молекулы ДНК, получили название топоизомераз. Наиболее изучена из них - бактериальная гираза, инициирующая образование отрицательных супервитков.

Функция ДНК

Генетическая информация, закодированная в последовательности нуклеотидов, служит двум целям. Во-первых, она необходима для синтеза белковых молекул, во-вторых, обеспечивает передачу самой себя в ряду клеточных поколений и поколений организмов. Обе функции основаны на том, что молекула ДНК служит матрицей; в первом случае для транскрипции - перекодирования информации в структуру молекул РНК и во втором для репликации - копирования информации в дочерних молекулах ДНК.

Комплементарность цепей двойной спирали Уотсона и Крика предполагает полуконсервативиый способ репликации ДНК. Это означает, что цепи расходятся и каждая служит матрицей для синтеза новой комплементарной последовательности (рис. 37.4). Две образовавшиеся двухспиральные молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной цепи, распределяются между двумя дочерними клетками (рис. 37.5). Таким образом, каждая из дочерних клеток получает информацию, идентичную той, которой обладала родительская клетка. В каждой из двух дочерних клеток сохраняется одна цепь от исходной родительской ДНК.

Полуконсервативиый механизм репликации у бактерии Escherichia coli был однозначно продемонстрирован в классическом эксперименте Мезелсона и Сталя с применением тяжелого изотопа азота в сочетании с равновесным центрифугированием.

Рис. 37.4. Двухцепочечная структура ДНК. Каждая из двух цепей родительской молекулы ДНК используется в качестве матрицы для синтеза новых комплементарных цепей. (From J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,

Рис. 37.5. Ожидаемое распределение цепей ДНК при полуконсервативной и консервативной репликациях. На рисунке родительские цепи - черные, а новые цепи - светлые. (Redrawn and reproduced, with permission from Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975.)

ДНК E. coli и ДНК человека химически идентичны, хотя, конечно, последовательности нуклеотидов в них отличаются и, кроме того, клетка человека содержит примерно в 1000 раз больше ДНК, чем бактериальная. Оказалось, что химический механизм репликации ДНК - один и тот же у прокариот, таких, как Е. coli, и эукариот, включая человека, несмотря на то что ферменты, вовлеченные в эти процессы, в клетках прокариот и эукариот различаются. Есть все основания считать, что данные, полученные при изучении химии нуклеиновых кислот прокариотических организмов, приложимы и к эукариотическим системам. Действительно, результаты экспериментов с клетками млекопитающих, аналогичных опытам Мезелсона и Сталя, оказались сопоставимыми с данными, полученными ранее на Е. coli.

Апериодичность и одномерность кристалла ДНК хорошо проявляется при его плавлении. Но во что при этом превращается одномерный кристалл? С ростом температуры межмолекулярные связи, которые удерживают вместе две комплементарные цепи, рвутся. При этом из одной двухнитевой молекулы получаются две однонитевые цепочки (смотрите рисунок ниже).

Так плавится ДНК

Энтропийно (получение большей свободы) это удобно потому, что, потеряв связь с комплементарным партнёром, каждая цепочка получает больше свободы. В результате этого приобретается способность создавать в пространстве самые разные конфигурации. А вот сами цепочки порвать простым нагреванием нельзя, так как нуклеотиды связаны между собой очень прочно. Разрезать их могут только ферменты нуклеазы.

Надо знать, что плавление ДНК кардинально отличается от плавления, к примеру, того же льда . А отличие заключается в том, что молекула плавится в широком интервале температур, а плавление льда осуществляется при одной строго фиксированной температуре. Называется это явление фазовым переходом , когда состояние вещества меняется скачкообразно: из твёрдого оно превращается в жидкое, а из жидкого в газообразное.

Все мы по несколько раз в день сталкиваемся с фазовым переходом, когда кипятим воду в чайнике. Во время кипения система вода–пар находится в точке фазового перехода, равной 100 градусам по Цельсию. Она ни на йоту не поднимется, пока вся вода не выкипит. Аналогичная ситуация наблюдается при таяние льда. Температура поднимается до 0 градусов по Цельсию и замирает на этой точке, пока весь лёд не превратится в воду. Только после этого температура воды начнёт подниматься.

Что же касается молекулы ДНК , то она отличается от фазовых систем тем, что её температура растёт непрерывно. С её повышением всё новые и новые участки двойной спирали трансформируются из спирального в расплавленное состояние.

Вначале специалисты никак не могли осознать, что такое необычное поведение вещества возможно. Первым данное свойство для одномерного кристалла осознал физик Л. Д. Ландау. Он заявил: "В любой одномерной системе не могут существовать фазы, так как они тогда стремились бы перемешиваться друг с другом". Данное утверждение известно как теорема Ландау .

Так вот, удивительная молекула как раз и является такой системой. Её небольшое отличие заключается лишь в апериодичности, так как присутствуют два сорта звеньев - пары Г-Ц и А-Т, которые различаются силой своих связей. Пара А-Т разрывается гораздо легче, чем пара Г-Ц, поэтому плавление ДНК осуществляется при низких температурах, так как в молекуле пар А-Т содержится больше.

Поэтому в молекуле фазы отсутствуют не потому, что они стремятся перемешаться друг с другом, а потому, что участки, обогащённые парами А-Т, начинают плавиться при более низкой температуре, чем участки с преобладанием пар Г-Ц. Отсюда получается поэтапный переход одного участка за другим при росте температуры, а не скачком.

Данную зависимость поглощения тепла от температуры хорошо отражает график, показанный на рисунке ниже. На нём видно, что вместо одного бесконечно узкого пика, характерного для плавления льда, существует множество пиков, характеризующих плавление отдельных участков молекулы ДНК. По ширине каждый такой пик соответствует примерно 0,5 градусам по Цельсию.

Дифференциальная кривая плавления ДНК

Конечно, теплопоглощение одной молекулы измерить невозможно. В эксперименте принимают участие миллиарды молекул. Но все они имеют одинаковую последовательность нуклеотидов. При определённой температуре у них раскрываются одни и те же участки. Поэтому, экспериментируя на множестве одинаковых молекул, можно судить о том, что происходит с каждой из них. Ниже приведён снимок расплавленной ДНК при температуре 72 градуса по Цельсию.

Так выглядит расплавленная ДНК при t=72° C

Следует учитывать, что каждая молекула имеет свой индивидуальный профиль плавления, зависящий от той генетической информации, которая в ней хранится. Но плавление ДНК нельзя рассматривать лишь как физическое явление. Данный процесс в клетке идёт постоянно, то есть комплементарные цепи разводятся для начала синтеза цепей. И каким же способом это происходит?

В роли своеобразного утюга, способного расплавить участок цепи, выступают специальные ферменты. В частности можно назвать РНК-полимеразу. Данный фермент прочно связывается с молекулой и расплетает её, но не любой участок, а лишь конкретную последовательность нуклеотидов, находящуюся между генами (промотор).

РНК-полимераза связывается с промотором и расплавляет его. При этом раскрывается около десятка нуклеотидов. Фермент движется вдоль гена и расплетает на своём пути новые участки, осуществляя по ходу движения синтез молекулы мРНК. Пройденные участки вновь соединяются. Синтезируемая РНК смещается, возле неё появляется рибосома и начинает синтезировать белок в соответствии с генетическим кодом. Вся эта схема показана на рисунке ниже.

РНК-полимераза, двигаясь по ДНК, синтезирует РНК
Рибосома считывает данные с РНК и синтезирует белок

Способность комплементарных цепей молекулы разъединяться и вновь соединяться широко применяется в генной инженерии . В настоящее время изобретено устройство, способное осуществлять полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Данное устройство получает образец ДНК и периодически нагревает и охлаждает его. В результате каждая молекула умножается в пробирке.

Можно начать с одной молекулы, провести m циклов ПЦР и получить 2 m молекул прямо в пробирке. Таким способом можно воспроизвести любой биологический организм в лабораторных условиях. Перспективы захватывающие, но пойдут ли они на благо человечеству?

Если медленно нагревать растворы вирусной или бактериальной ДНК, то их молекулы денатурируют при вполне определенных температурах (рис. 27-16). Переход от нативного дуплекса ДНК к расплетенной беспорядочно скрученной денатурированной форме можно обнаружить по увеличению поглощения ультрафиолетового света или по уменьшению вязкости раствора ДНК. Для каждого вида ДНК характерна своя температура денатурации, называемая «точкой плавления». Чем выше содержание в ДНК пар G=C, тем выше точка плавления этой ДНК. Это объясняется тем, что пары GC более стабильны и на их диссоциацию требуется больше энергии, чем на разрушение пар А=Т; отчасти это обусловлено тем, что пары G=C соединены тремя водородными связями, а пары А=Т - лишь двумя.

Тщательное определение точки плавления препарата ДНК при фиксированных условиях pH и ионной силы может дать, следовательно, информацию о соотношении пар А=Т и G=C в ДНК.

Второе физическое свойство ДНК, обусловленное соотношением пар G=C и А=Т, это плавучая плотность. Препарат ДНК с более высоким содержанием G=C-nap обладает чуть большей плотностью, чем ДНК с повышенным содержанием А=Т-пар. Препараты ДНК центрифугируют при высоких скоростях в концентрированном растворе хлористого цезия (), плотность которого лежит в том же диапазоне, что и плотность ДНК.

Рис. 27-15. Принцип гибрилизационного теста. Два препарата ДНК, выделенной из организмов разных видов нагревают так, что они полностью денатурируют и их цепи расходятся. При смешивании этих препаратов и медленном охлаждении комплементарные цепи ДНК каждого вида найдут друг друга и будут ренатурировать с образованием нормальных дуплексов. Если между двумя ДНК существует значительная гомология по последовательности, то возможно образование гибридных молекул, представляющих собой частичные дуплексы. Чем выше степень гомологии, тем больше вероятность образования гибридов. Содержание гибридов в смеси можно измерить разными способами, в частности с помощью хроматографии или центрифугирования в градиенте плотности. Обычно, чтобы упростить процедуру измерения, одну из ДНК метят радиоактивным изотопом

Рис. 27-16. Кривая денатурации (плавления) двух препаратов ДНК. Температура, соответствующая средней точке перехода называется точкой плавления. Поскольку величина зависит от pH и концентрации соли, всегда надо конкретизировать условия ее измерения.

При центрифугировании в центрифужной пробирке формируется градиент плотности с наибольшей плотностью у дна пробирки. Если поместить в нее ДНК, то она сначала будет перемещаться по направлению ко дну пробирки, но затем в определенном положении остановится и будет держаться на плаву. В этом положении она не может ни всплыть, ни осесть, поскольку плотность раствора здесь равна ее плотности. С помощью этого метода, более подробно описанного в гл. 28, можно отделить друг от друга молекулы ДНК, различающиеся по содержанию G=С-пар, поскольку они обладают разной плавучей плотностью. Исходя из плавучей плотности данной ДНК, можно подсчитать соотношение в ней пар G=С и А=Т.